Objetivo: Analisar os limiares de reflexo acústico obtidos em neonatos com tons sonda de 226 e 1000Hz. Método: Foram avaliados 71 neonatos, 36 do gênero feminino e 35 do masculino, com idade entre 4 e 29 dias, emissões otoacústicas presentes e ausência de fatores de risco para perda auditiva. Todos foram submetidos à pesquisa dos reflexos ipsilaterais e contralaterais usando tom sonda de 226 e 1000Hz. Os reflexos acústicos ipsilaterais foram pesquisados com estímulos em 1000 e 2000Hz e os reflexos acústicos contralaterais com estímulos em 500, 1000, 2000 e 4000Hz. A pesquisa foi realizada no Serviço de Fonoaudiologia do Hospital Nossa Senhora da Conceição de Porto Alegre, utilizando o imitanciômetro Interacoustics Audiotest 425h. Na análise estatística dos dados aplicaram-se os testes t-student para amostras pareadas e t-student para amostras independentes. Resultados: Observamos diferença estatisticamente significante (p<0,05) na comparação entre os tons sonda de 226 e 1000Hz e reflexos acústicos ipsilaterais e contralaterais com estímulos em 1000 e 2000Hz em ambas as orelhas. Na comparação dos tons sonda entre as orelhas encontramos significância estatística para ambas com estímulo pesquisado em 2000Hz no reflexo contralateral. Também observamos significância estatística na comparação das médias dos limiares de reflexo acústico em relação ao gênero na OD para o tom sonda de 1000Hz nos reflexos ipsilaterais em todos os estímulos apresentados e contralaterais com estímulos em 500 e 1000Hz. Conclusão: Na análise dos limiares dos reflexos acústicos verificamos diferença estatisticamente significante entre os tons sonda de 226 e 1000Hz, gênero e orelha em neonatos.