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Ano: 2005  Vol. 9   Num. 3  - Jul/Set Print:
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Utilizao da Esclera Bovina para Correo de Fratura em Assoalho de rbita de Coelhos
Bovine Sclerae Graft for Orbital Floor Fracture in Rabbits
Author(s):
Jos Mariano Carvalho Costa*, Lucas Gomes Patrocnio**, Rafael De Rossi***, ngela B. C. Amorim****, Jos Antnio Patrocnio*****.
Palavras-chave:
esclera, biomateriais, implantes, silicone, fratura e assoalho de rbita.
Resumo:

Introduo: A fratura do assoalho de rbita freqentemente causa grandes defeitos sseos, que demandam o uso de enxertos e/ou implantes para sua reconstruo. Vrios materiais j foram empregados para este fim (cartilagem septal, cartilagem conchal, silicone, entre outros). Objetivo: Estudar a esclera bovina como material de barreira em fraturas programadas em assoalho de rbita de coelho evitando a herniao de gordura e msculo da rbita para o seio maxilar, atravs do estudo do seu comportamento de biocompatibilidade. Mtodos: Foram utilizados 18 coelhos da raa Nova Zelndia, machos com idade mdia de 6 a 8 semanas pesando em mdia 2,8 Kg. Os animais foram distribudos por sorteio em 2 grupos de 9 animais cada. No primeiro grupo, o defeito sseo padro foi confeccionado no rebordo infra-orbitrio esquerdo e preenchido com esclera bovina. Nos animais do grupo 2 o defeito sseo padro foi preenchido com lmina de silicone duro do lado direito. Cada grupo foi dividido em 3 sub-grupos com 3 animais, os quais foram sacrificados aos 30, 45 e 60 dias. Resultados: Nos animais submetidos ao implante de silicone, evidenciou-se reao inflamatria leve aos 30 dias, com ausncia de inflamao aos 45 e 60 dias. Em contraste, no grupo que recebeu esclera bovina, houve reao inflamatria severa em 30 dias, moderada aos 45 dias e ausncia de infiltrado inflamatrio aos 60 dias. Concluses: Ambos materiais implantados foram biocompatveis, inicialmente causando discreto edema clnico e reao inflamatria crnica granulomatosa inespecfica que desapareceu aos 60 dias (mais rapidamente no grupo controle com implante de silicone). Permitiram regenerao ssea parcial, no sendo reabsorvidos e funcionando como material de barreira.

INTRUDUO

Entre os tecidos altamente organizados, o osso tem um potencial nico de reconstruir sua estrutura original aps um defeito ou uma fratura. Em condies instveis, predomina a cicatrizao indireta ou secundria, via formao intermediria de fibrocartilagem sucedida por ossificao endocondrial. Em condies estveis, o osso formado direto ou primariamente, constando que duas condies fundamentais devem ser preenchidas: amplo suprimento sangneo e uma base slida para deposio ssea (1).

Porm a capacidade regenerativa do osso limitada pelo tamanho da leso, de tal forma que defeitos sseos extensos, provocados por trauma, tumores, infeces e anomalias de desenvolvimento, no se regeneram espontaneamente, representando um problema desafiante para a comunidade cientfica (2).

A fratura do assoalho de rbita freqentemente causa grandes defeitos sseos, que demandam o uso de enxertos e/ou implantes para sua reconstruo. Vrios materiais j foram empregados para este fim (cartilagem septal, cartilagem conchal, silicone, entre outros) (3).

A esclera a camada externa do olho, densa, branca, fibrosa e muito resistente, que protege o olho. Contnua crnea anteriormente e ao revestimento dural do nervo ptico. A esclera humana, por apresentar-se em abundncia nos hospitais aps a retirada das crneas doadas, poder ser usada como material de barreira em fraturas do assoalho de rbita.

Como a esclera bovina histologicamente semelhante esclera humana, realizamos este estudo com o objetivo de avaliar a eficcia da esclera bovina como barreira em fraturas-padro programadas no assoalho da rbita de coelhos, evitando a herniao de gordura, msculo reto inferior e vscera ocular, atravs do estudo do seu comportamento de biocompatibilidade.

Material e Mtodos

Animais de Experimentao

Uma vez que o coelho oferece fcil controle de variveis como idade, sexo, peso, higiene e so de fcil manuseio e manuteno, foram utilizados 18 coelhos isgenos da linhagem Nova Zelndia (Qryctolagus cuniculus), albinos, machos, de seis a oito meses de idade, peso mdio 2,8 quilogramas (Kg), fornecidos pelo Laboratrio de Veterinria da Universidade Federal de Uberlndia (UFU-MG).


Figura 1. Algoritmo demostrando aleateorizao dos grupos,
de acordo com tipo de implante (esclera ou enxerto) e dia de
avaliao no ps-operatrio (30, 45 ou 60 dias).


Definio dos Grupos de Estudo

Neste ensaio clnico randomizado, os animais foram distribudos de forma aleatria em 2 grupos de 9 animais, de acordo com o material utilizado. Aps a realizao dos experimentos cirrgicos em cada grupo, ambos foram subdivididos em trs subgrupos de 3 animais para avaliao histopatolgica em datas diferentes (30, 45 e 60 dias de ps-operatrio) que expressassem a compatibilidade tecidual, possvel reao imunolgica e, conseqentemente, a reparao ssea.

GI (experimento): 9 coelhos com defeito sseo padro no rebordo infra-orbitrio esquerdo e preenchido com esclera bovina (subdivididos em GI-30, GI-45, GI-60).

GII (controle): 9 coelhos com defeito sseo padro no rebordo infra-orbitrio direito e preenchido com bloco de silicone (subdivididos em GII-30, GII-45, GII-60) (Figura 1).

As cirurgias, bem como os ps-operatrios, foram realizados no Laboratrio de Tcnica Cirrgica do Hospital de Veterinria da UFU-MG.

Preparo dos Implantes

Foram retirados seis globos oculares e armazenados em um pote de vidro previamente esterilizado, contendo soluo alcalina (soro fisiolgico). Em um segundo tempo, as escleras foram separadas e conservadas em glicerina, do mesmo modo como dura-mater, crneas e cartilagem so mantidos para posterior utilizao como implante (4) (Figura 2).


Figura 2. Esclera bovina conservada em glicerina a 98% a ser utilizada com enxerto no assoalho da rbita dos coelhos.


Tanto o silicone como a esclera bovina foram preparadas com medida padronizada de 1 cm de comprimento X 0,5 cm de largura X 1 mm de espessura, fazendo-se a isometria entre os implantes (Figura 3).


Figura 3. Implantes (silicone esquerda e esclera bovina direita) preparados em medida preconizada de 1 cm de comprimento X 0,5 cm de largura X 1 mm de espessura.


Procedimentos Operatrios

Uma vez anestesiados, os animais foram colocados lateralmente sobre a mesa cirrgica. Os defeitos sseos foram realizados com broca preconizada (tronco-cnica de ao n 703 - para pea reta). A fratura ssea padro foi realizada com espessura de 1 mm (dimetro da poro mais calibrosa da ponta ativa da broca) e 5 mm de comprimento (medida da ponta ativa da broca em seu longo eixo) (Figura 4). Foram realizadas com a mesma broca duas perfuraes eqidistantes nas bordas da fratura (2 mm) para que fossem feitas as fixaes das escleras bovinas e silicone duro, com fio de ao 2-0, no assoalho da rbita mantendo-os dessa forma in situ (Figura 5). A sntese da pele foi realizada com sutura intradrmica com Mononylon 4-0 e posteriormente com alguns pontos simples como medida complementar de segurana.


Figura 4. Fratura ssea padro no assoalho orbitrio dos coelhos realizada com broca tronco-cnica de ao n 703 para pea reta, de espessura de 1 mm (dimetro da poro mais calibrosa da ponta ativa da broca) e 5 mm de comprimento (medida da ponta ativa da broca em seu longo eixo), alm de duas perfuraes eqidistantes nas bordas da fratura (2 mm).



Figura 5. Colocao do implante de esclera bovina no local da fratura-padro realizada no assoalho orbitrio dos coelhos.


Coleta e Preparao do Material para Exame Morfolgico

Decorrido o perodo de observao de 30, 45 e 60 dias, os animais foram submetidos anestesia similar do ato operatrio, seguida de injeo endovenosa de cloreto de potssio 19,1%, na dose de 2 mL e tiopental sdico 1,0 g, promovendo a eutansia.

A seguir realizou-se o procedimento cirrgico atravs de direse de tecido mole e osteotomia para remoo do bloco sseo do assoalho da rbita contendo o implante.

Aps o perodo de 48 horas, as peas obtidas foram lavadas em gua corrente para retirar o excesso de fixador (formol tamponado a 10%) e em seguida, o processo de descalcificao foi iniciado. As peas foram imersas em soluo descalcificante de EDTA 5,5g, 90 mL de gua e 40 mL de formol 37-40% para remoo da parte mineral da matriz ssea mineralizada. Seis dias aps, as peas foram lavadas em gua corrente para retirada do excesso de EDTA e submetidas desidratao em lcoois etlicos (70%, 90% e 100%, consecutivamente), diafanizao em sabo p.a e incluso em parafina histolgica (5).

Os blocos foram seccionados com micrtomo, ajustados para 5 mm de espessura e os cortes foram semi-seriados no sentido ltero-lateral. As lminas assim obtidas da matriz ssea descalcificada foram coradas com hematoxilina e eosina e observadas ao microscpio ptico.

Anlise Clnica e Macroscpica

Os resultados foram estatisticamente analisados clinicamente quanto presena de eritema, edema, secreo, hematoma ou equimose na regio orbitria (conjuntiva e esclertica) e na pele infra-ocular. A avaliao clnica ao final dos 30, 45, 60 dias considerou tambm a presena de eritema, necrose, edema, aderncias e se houve incorporao do material ao tecido sseo ou conjuntivo da rea. Esses registros foram baseados em avaliao semi-quantitativa considerando (0) ausente, (+) leve, (++) moderado ou (+++) acentuado.

Avaliao Microscpica

Os implantes foram avaliados histologicamente pela colorao hematoxilina e eosina, por meio de microscpio ptico de luz visvel e com as ampliaes mais adequadas para cada item observado. Foram consideradas nesta anlise:

1. a composio celular do infiltrado inflamatrio, classificando-os como agudo (predominantemente composto por neutrfilos) e crnico (predominantemente composto por linfcitos, plasmcitos e macrfagos, considerados em conjunto ou isoladamente) (6);

2. a intensidade do infiltrado, mensurado a partir da avaliao e sua intensidade: (0) ausente; (+) leve; (++) moderado; (+++) acentuado.

Esta avaliao teve carter comparativo entre os dois grupos testados com a relao dinmica da formao do processo de reparo sseo. Os resultados foram expressos segundo os critrios descritos acima e representados por meio de fotomicrografias das reas mais expressivas.

Comisso de tica

O presente estudo foi aprovado pela Comisso tica no Uso de Animais CEU/UFMS, em reunio de 15/12/2003, estando de acordo com os princpios ticos adotados pelo Colgio Brasileiro de Experimentao Animal (COBEA).

Resultados

Aspectos gerais no ps-operatrio

Os animais suportaram bem a anestesia e o ato cirrgico sem registro de ocorrncias tanto no perodo pr, trans e ps-operatrio. Durante o acompanhamento ps-cirrgico dos dois grupos (Silicone e Esclera Bovina) no foi registrado nenhum sinal de complicaes ps-cirrgicas imediatas ou tardias. Todos os animais apresentaram apenas edema discreto (+) no ps-operatrio.

Observaes macroscpicas

A Tabela 1 demonstra as observaes macroscpicas dos blocos sseos do assoalho de rbita dos coelhos incluindo os implantes de Silicone e Esclera Bovina com 30, 45 e 60 dias.
Observaes microscpicas

Tabela 1. Observaes macroscpicas das alteraes dos blocos sseos retirados da rea receptora dos implantes com 30, 45 e 60 dias de ps-operatrio.


O Grfico 1 demonstra a avaliao microscpica comparando o grupo de silicone e esclerose bovina aos 30, 45 e 60 dias.


Grfico 1. Avaliao microscpica comparando o grupo de silicone e esclerose bovina aos 30, 45 e 60 dias de psoperatrio.


As Figuras 6 a 11 detalham as observaes microscpicas de todos os grupos.


Figura 6. Fotomicrografia de amostra do GI-30 demonstrando presena de tecido sseo lamelar, com aspecto de osso cortical, apresentando na regio referente ao trao de fratura um tecido conjuntivo fibroso, com aspecto fibrilar (frouxo), sendo preenchido, parcialmente, por tecido sseo neoformado (seta grande). Pode-se observar em torno da rea do silicone (seta pequena) um tecido conjuntivo fibro-celular, pobremente infiltrado por leuccitos mononucleares (crculo)
(200X).



Figura 7. Fotomicrografia de amostra do GII-30 demonstrando linha de fratura, ocupada por tecido conjuntivo fibroso, rico em fibroblastos, com trabculas sseas incipientes em ambos cotos sseos e um grande nmero de osteoblastos (seta grande). A regio de implantao da esclera (asterisco) estava ocupada por infiltrado inflamatrio em parte neutroflico, em parte linfo-histiocitrio (setas pequenas), permeando o tecido perifericamente e invadindo-o parcialmente em determinadas reas, em direo ao centro do fragmento (20X).



Figura 8. Fotomicrografia de amostra do GI-45 demonstrando maior deposio de fibras colgenas em torno do fragmento de silicone, permitindo a percepo da forma do material includo no tecido. Identificam-se alteraes sseas significativas j compatveis com o fechamento da ferida, percebendo-se osso lamelar com aspecto homogneo em todo o segmento sseo examinado (20X).



Figura 9. Fotomicrografia de amostra do GII-45 demonstrando osso ntegro com reas de soluo de continuidade preenchida por resposta inflamatria intensa, perifericamente a esclera, do tipo linfo-plasma-histiocitrio. A esclera se molda em depresses do tecido sseo, associada ao infiltrado inflamatrio linfo-histiocitrio sem, contudo, estar associado sinais expressivos de reabsoro no osso adjacente. Neste perodo, j h sinais de reparao avanada do osso lesado que apresenta-se com aspecto lamelar (200X).



Figura 10. Fotomicrografia de amostra do GI-60 demonstrando trmino do reparo sseo (setas). Nota-se o padro lamelar classicamente evidenciado para o osso maduro. No foi possvel identificar infiltrado inflamatrio prximo rea do silicone implantado ou mesmo na regio da regenerao ssea (20X).



Figura 11. Fotomicrografia de amostra do GII-60 demonstrando que a rea da leso ssea encontra-se quase que totalmente regenerada, sem a presena de infiltrado inflamatrio. Nota-se, no local, tecido conjuntivo fibroso frouxo, vascularizado e sinais de remodelao ssea (setas). H evidncias de leso ainda no fechada (200X).


Discusso

Diferentes e mltiplos materiais tm sido utilizados na correo da fratura de rbita, tais como: silicone, teflon, supramid, polietileno (Porex), osso ou cartilagem autgena, hidroxiapatita, etc (3). O enxerto ideal seria aquele que tivesse a forma, consistncia e resistncia da estrutura defeituosa. Deveria ser facilmente obtido e moldado, e de baixo custo. Ademais, deveria causar o mnimo de reao tecidual e resistir extruso e reabsoro pelo corpo (7).

Pesquisando a literatura, observamos a grande quantidade de trabalhos direcionados para a reconstruo parcial ou total do organismo humano. Quando escolhemos a esclera para pesquisa, analisamos suas vantagens sobre essa gama de materiais biocompatveis, entre elas o custo para os hospitais e para o prprio paciente, pois a esclera doada junto com a crnea. Alm disso, um material de fcil aquisio por ter em grande quantidade nos hospitais credenciados para receber ou retirar crneas de doadores. Outra propriedade da esclera seria a manipulao para remodelar, adaptar e se fixar no leito receptor. Sua conservao se faz em glicerina 98%, que mantm a integridade celular (4,8,9). Estudamos a esclera humana tambm para enquadr-la entre os biomateriais. Durante o estudo foi observado no grupo de animais com esclera bovina, uma boa adaptao, fixao e acomodao no leito receptor, no havendo deslocamento da esclera e modelado facilmente conforme a anatomia da rea receptora.

O silicone foi escolhido como material para o grupo controle por ser um implante extensivamente estudado nas enoftalmias traumticas. Apresenta, porm, como desvantagens poder ser visvel sob a pele, mesmo tendo sido esculturalmente modelado, alm de existir a possibilidade de expulso do leito receptor (3,7). J referente ao nosso material em pesquisa, por ser orgnico, essas desvantagens no existem, pois h grande facilidade de fixao com fios cirrgicos diversos.

A pele outro implante usado em grande escala nas exenteraes, porm com duas grandes desvantagens: a) possibilidade de crescer plos; b) possibilidade de produzir secrees (7). No implante com esclera no existem essas desvantagens.

No estudo da reao do tecido conjuntivo subcutneo aos implantes de derme humana acelular (Alloderm) e membrana de politetrafluoretileno (teflon) em ratos, verificou-se que no perodo tardio (90 dias) o teflon apresentou formao e cpsula fibrosa, sem reao inflamatria. Porm um material de alto custo para os hospitais e os pacientes (8).

Na pesquisa da evoluo de enxertos sseos autgenos e algenos colocados em defeitos sseos de tamanho crtico em calvria de cobaias, Urist et al. (9) demonstraram que fatores osteoindutivos do osso endocondral induzem a formao ssea passando por um estgio de cartilagem hialina. Em referncia ao resultado do nosso estudo com a esclera bovina, podemos at mesmo concordar que haja alguma substncia tambm osteoindutora, pois, alm de cumprir o papel de barreira, permitiu a formao ssea no final da pesquisa.

Foi realizado estudo usando a esclera humana e o politetrafluoretileno como material alternativo no tratamento de perfurao escleral em coelho. A evoluo do ps-operatrio dos animais foi analisada diariamente por um ms, classificando a intensidade da hiperemia ocular nas seguintes categorias: O (ausente), + (hiperemia leve), ++ (hiperemia moderada) e +++ (hiperemia intensa), alm da presena ou ausncia da secreo ocular (10).

Nosso estudo usa a esclera bovina nas fraturas programadas em assoalho de rbita de coelho. A presena de inflamao (+++) no grupo de esclera bovina no perodo de 30 e 45 dias, vindo a ser (++) no final da pesquisa, possivelmente est relacionada com o uso de implante (esclera) em forma inatura. Apesar disto, demonstrou caractersticas semelhantes a escleras homlogas usadas para correo de leses diversas em escleras.

Foi estudada a implantao de placas ferromagnticas na esclera de coelhos com o objetivo de neutralizao de nistagmos e obteno de uma posio ocular normal aps uma correo de estrabismo e principalmente sua estabilizao ao longo do tempo. Essa pesquisa teve a intensidade de inflamatrio avaliada da seguinte forma: dois observadores independentes utilizaram os seguintes parmetros para avaliaes: -: ausente; + presente, mas discreta; ++: moderada; +++: acentuada; Secreo conjuntival: ausente (a); ou presente (p); Presena de nervo: ausente (a) ou presente (p). A reao inflamatria nesse estudo permaneceu at o 28 dia (11). No nosso estudo com a esclera bovina, tivemos o processo inflamatrio presente em condio leve at o grupo de animais sacrificados com 60 dias (ltimo sub-grupo da pesquisa).

Na pesquisa com a esclera bovina inatura, conclumos basicamente que o material de fcil manuseio, fcil adaptao e modelagem na rea receptora. Agiu como barreira, pois ao final de 60 dias fibrosou e permitiu a formao ssea na periferia da fratura-padro programada.

A fratura-padro programada do grupo controle (silicone) aos 60 dias, j tinha se fechado enquanto que no grupo de pesquisa (esclera bovina) de 60 dias, ainda no havia se fechado completamente. A esclera bovina mostrou que poder vir a se integrar no grupo de bio-materiais, cabendo, porm, outros estudos que possam adequ-la em uma linha de pesquisa a ser intensamente testada. Segundo Medawar "Congelamento e liofilizao so mtodos aparentemente capazes de destruir partculas e a vitalidade celular, portanto diminuindo a capacidade imunolgica do enxerto (implante) e preservando a matriz intacta para um futuro enxerto (implante)" (12). O congelamento e a liofilizao do material torna-se o passo natural do estudo deste enxerto nas fraturas de rbita.

Concluses

Conclui-se que, em fraturas programadas em assoalho de rbita de coelhos, ambos os materiais implantados foram biocompatveis, inicialmente causando discreto edema clnico e reao inflamatria crnica granulomatosa inespecfica que desapareceu aos 60 dias (mais rapidamente no grupo controle com implante de silicone). Ademais, permitiram regenerao ssea parcial no perodo estudado (60 dias), no sendo reabsorvidos e funcionando como material de barreira contra herniao do material orbitrio para o seio maxilar.

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