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Ano: 2007  Vol. 11   Num. 1  - Jan/Mar Print:
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Fator de Crescimento Epitelial e Pentoxifilina nas Perfuraes Subagudas de Membrana Timpnica
Epidermal Growth Factor and Pentoxifylline in Subacute Tympanic Membrane Perforations
Author(s):
Jeanne da Rosa Oiticica Ramalho
Palavras-chave:
Chinchila. Fator de crescimento epitelial. Orelha mdia. Pentoxifilina. Timpanoplastia. Cicatrizao.
Resumo:

Introduo: O fator de crescimento epitelial uma citocina capaz de modular a proliferao de clulas epiteliais e endoteliais in vitro e in vivo. A pentoxifilina uma metilxantina que tem sido usada para tratar enxertos de pele e lceras venosas cutneas. A literatura sobre o tema controversa e carece de quantificao objetiva das aes dos dois frmacos. Objetivos: Os objetivos deste estudo foram determinar o efeito do fator de crescimento epitelial e da pentoxifilina e quantificar o percentual de cicatrizao de perfuraes subagudas de membrana timpnica tratadas com estes frmacos isolados ou associados, comparando os resultados obtidos com o observado em um grupo controle. Material e Mtodo: Quarenta e duas chinchilas foram submetidas a procedimento para criar perfurao de membrana timpnica. Aquelas com cicatrizao inferior a 10% foram distribudas em quatro grupos: controle, fator de crescimento epitelial, pentoxifilina ou fator de crescimento epitelial com pentoxifilina. Resultados: O percentual de cicatrizao de perfuraes subagudas de membrana timpnica no perodo de 30 dias mostrou diferena estatisticamente significante entre os grupos (ANOVA; p < 0,001) e foi de 30,3% no grupo fator de crescimento epitelial, de 3,6% no grupo pentoxifilina, de 16,5% no grupo fator de crescimento epitelial com pentoxifilina e de 8,7% na ausncia de tratamento. Concluses: O fator de crescimento epitelial auxiliou o processo de cicatrizao de perfuraes subagudas de membranas timpnicas de chinchilas, o que no se observou com a pentoxifilina. A associao da pentoxifilina com o fator de crescimento epitelial no potencializou seu efeito.

INTRODUO

As perfuraes de membrana timpnica (MT) so orifcios decorrentes de alteraes estruturais do tecido timpnico, caracterizando-se histologicamente por epitelizao dos seus bordos (1).
O tratamento das perfuraes de MT tem focado duas principais linhas de pesquisa cientfica. A primeira inclui a cicatrizao das perfuraes por meio de novas matrizes proticas que promovam suporte e sirvam de guia para o tecido em regenerao (miringoplastia) (2, 3). A segunda visa induzir a proliferao e migrao celular por meio de mitgenos (fatores moduladores de crescimento) ou indutores do fluxo sanguneo (agentes hemorreolgicos).
O fator de crescimento epitelial (FCE) uma citocina capaz de modular a proliferao e quimiotaxia de clulas epiteliais, endoteliais, fibroblastos e queratincitos (4-6). Receptores especficos para o FCE foram detectados na MT de animais e de humanos (7-9). Estudos experimentais e ensaios clnicos investigaram a eficcia do FCE em promover a cicatrizao de perfuraes de MT. Alguns observaram diferena estatisticamente significante entre os grupos controle e de estudo (7, 10, 11), enquanto outros no (12, 13).
A pentoxifilina (PX) uma metilxantina capaz de promover o aumento do fluxo sanguneo e da tenso de oxignio em tecidos com microcirculao perifrica deficitria (14). Tem sido usada no tratamento de retalhos cutneos e de lceras venosas de perna (15-17). Contudo, o nico estudo experimental em perfuraes agudas de MT no conseguiu mostrar benefcios com o uso da PX (18). A literatura sobre o tema controversa e carece de quantificao objetiva das aes do FCE e da PX na cicatrizao de perfuraes de MT.
O tratamento inicial das perfuraes traumticas de MT a observao clnica, a correo cirrgica est indicada apenas nos casos em que no se observar cicatrizao espontnea aps perodo mnimo de trs meses (19, 20). A idia central foi testar experimentalmente um mtodo simples e no invasivo que possa servir como opo de tratamento em perfuraes traumticas de MT no cicatrizadas em sua fase aguda. Deste modo, optamos por estudar o efeito de substncias indutoras de cicatrizao numa fase subaguda da perfurao, aproveitando uma possvel atividade mittica residual antes que a perfurao venha a ter indicao cirrgica.
Delineamos este estudo experimental para testar as seguintes hipteses: o FCE e a PX aumentam o percentual de cicatrizao (PC) de perfuraes de MT e a associao dos dois frmacos tem efeito sinrgico sobre o PC. Para testar estas hipteses o objetivo deste estudo foi determinar e quantificar o efeito do FCE e da PX, isolados ou associados, na cicatrizao de perfuraes subagudas de MT de chinchilas.

MATERIAL E MTODO

O projeto de pesquisa foi aprovado pela Comisso de tica para Anlise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq) do Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo (FMUSP), sob protocolo de pesquisa n 853/04. O experimento foi realizado no Laboratrio de Investigao Mdica (LIM - 32) do Departamento de Otorrinolaringologia, em concordncia com o manual sobre cuidados e usos de animais de laboratrio (21). A pesquisa foi financiada por verba de auxlio pesquisa, aprovada pela Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP), processo n 02/08285-0.
Foram inicialmente selecionadas 42 chinchilas (Chinchilla. langera) de ambos os sexos, com idade entre sete e vinte meses, peso entre 400 g e 800 g, obtidas a partir de criadores especializados (CHILLN - Criao de Chinchilas, Reprodutores e Matrizes / ACHILA - Associao Brasileira de Criadores de Chinchilas). Os animais foram mantidos pelo prprio criador em gaiolas individuais, com gua e rao vontade. Exclumos animais com infeco da orelha externa ou mdia, fmeas gestantes e portadores de malformaes congnitas.
Todos os animais foram submetidos a procedimento para criar perfuraes de MT em ambas as orelhas. A induo anestsica foi feita via subcutnea, utilizando-se agulha e seringa de insulina para injeo de cloridrato de xilazina a 2% (3 mg/kg) seguida de clorohidrato de quetamina (17 mg/kg). O procedimento foi realizado do incio ao trmino sob viso endoscpica, utilizando-se endoscpio rgido com ngulo de viso de 30o e 2,7 mm de dimetro.
A rea total da MT foi calculada usando um molde de silicone de 0,5 mm de espessura (Xomed Surgical Products, Jacksonville, FL, USA), confeccionado no formato da membrana de forma a recobrir toda sua superfcie. A perfurao foi padronizada para todos os animais em formato e em tamanho, a partir da confeco de um segundo molde, correspondendo metade da rea total do primeiro molde de silicone e aos quadrantes inferiores da MT (Figura 1).



O molde de perfurao foi posicionado sobre os quadrantes inferiores da MT. A miringotomia foi realizada nos limites do molde utilizando-se a energia trmica do eletrodo ponta agulhada, angulao de 90o na extremidade distal e 0,3 mm de dimetro, acoplado ao bisturi eletrnico (BP-100, EMAI, So Paulo, Brazil) ajustado em 15 W de potncia (Figura 2A). A MT remanescente foi submetida a cinco incises perpendiculares ao nulus. As ilhas de tecido tiveram seus bordos medializados e cauterizados de encontro camada interna (Figura 2B).



As imagens foram obtidas usando micro-cmera (Sony DXC-LS1) e endocoupler (22 mm) acoplado ao endoscpio, importadas do sistema de vdeo para o computador. Um programa grfico (AutoCAD R14) permitiu o clculo da rea total da MT e da rea de perfurao (Figura 3).



A profilaxia contra infeces foi feita com enrofloxacina na dose de 5 mg/kg/d, via oral, nos primeiros cinco dias aps perfurao da MT e nos 10 dias do protocolo de tratamento das perfuraes.



Decorridos 30 dias, os animais dos quais pelo menos uma orelha apresentou cicatrizao inferior a 10% do percentual de rea perfurada (PAP) inicial foram includos no protocolo de tratamento (Figura 4). Foram excludas as orelhas com infeco. As orelhas selecionadas constituram quatro grupos de estudo: grupo controle (recebeu gua destilada tpica), grupo FCE (tratado com FCE tpico), grupo PX (recebeu PX por via oral e gua destilada tpica), grupo FCE + PX (tratado com FCE tpico e PX por via oral).
Um fragmento de esponja estril de gelatina absorvvel (Gelfoam, Pharmacia Brasil Ltda, So Paulo, Brasil), confectionado de acordo com o molde da MT, foi posicionado de forma a ocupar toda superfcie remanescente da MT. Solues tpicas contendo 25l de gua destilada ou 0,25 mg/ml de FCE (Biogen, Cambridge, MA, USA) foram aplicadas sobre a esponja, usando micropipeta de volume fixo de 25l (Socorex - Acura, Cral, Cotia, Brasil), a cada 72 horas, por dez dias (total de trs aplicaes), aps os quais a esponja foi removida (Figura 5). A PX foi administrada na dose de 20 mg/kg/d, por via oral, a cada 12 horas, por dez dias, coincidindo com o perodo de uso das solues tpicas.



O sacrifcio foi feito com os animais alojados em uma cmara de CO2, por perodo no inferior a dez minutos (22). Aps o sacrifcio, os animais foram devidamente acondicionados em lixo hospitalar.
O PAP foi calculado dividindo-se a rea perfurada pela rea total da MT e multiplicando-se por 100. O PC da perfurao de MT em um ms foi definido como a diferena entre o PAP no incio do protocolo de tratamento e o observado 30 dias aps.
O efeito final do tratamento sobre as perfuraes de MT foi classificado em: cicatrizao ausente quando o PC foi inferior a 10%, cicatrizao parcial quando o PC foi igual ou superior a 10% e cicatrizao total quando no se observou perfurao 30 dias aps o incio do tratamento.
Os dados obtidos foram submetidos anlise descritiva. O PAP e o PC das perfuraes de MT foram calculados em cada grupo. As variveis categricas (efeito final do tratamento nas perfuraes de MT) foram descritas por meio de sua frequncia e comparadas entre grupos usando o teste exato de Fisher. As variveis contnuas (PAP e PC) foram descritas por meio de suas mdias e desvios-padro e submetidas anlise de varincia com um fator ("one-way" ANOVA). A comparao dos grupos dois a dois foi feita pelo teste "post-hoc" de Bonferroni. Admitiu-se nvel de significncia estatstica de p < 0,05. A anlise estatstica foi realizada com uso de programa estatstico (STATA 8.0 TM).

RESULTADOS

A amostra inicial foi constituda por 42 animais (84 orelhas) submetidos a procedimento padronizado para criao de perfurao bilateral de MT. Decorridos 30 dias do procedimento, 38 orelhas (45,2%) foram excludas por cicatrizao parcial ou total da perfurao, por retrao cicatricial excessiva com MT residual escassa e infeco, ou por bito dos animais durante a induo anestsica (Figura 6). A amostra final foi constituda por 46 orelhas (54,8%) cuja perfurao cicatrizou menos que 10% aps 30 dias e foram includas no protocolo de tratamento. Durante esta etapa, trs animais foram perdidos por bito na induo anestsica e, portanto, seis orelhas foram excludas da anlise dos dados. As 40 orelhas (47,6%) restantes foram distribudas entre os grupos de tratamento da seguinte maneira: 9 no grupo controle, 8 no grupo FCE, 13 no grupo PX e 10 no grupo FCE + PX.





Como podemos observar na Figura 7, houve cicatrizao total da perfurao em apenas uma (10%) orelha do grupo FCE + PX. Neste mesmo grupo a cicatrizao parcial ocorreu em sete (70%) orelhas e a ausncia de cicatrizao em duas (20%) orelhas. As oito (100%) orelhas do grupo FCE apresentaram cicatrizao parcial, o que tambm ocorreu em cinco (55%) orelhas do grupo-controle e em cinco (38,5%) orelhas do grupo PX. A diferena observada na distribuio dos resultados mostrou-se estatisticamente significante pelo teste exato de Fisher (p = 0,007).
Antes do incio do tratamento, os grupos no apresentaram diferena entre as mdias do PAP (ANOVA; p = 0,572; Tabela 1). O PAP mdio neste momento era cerca de 50%. Trinta dias aps o tratamento, os grupos apresentaram diferena estatisticamente significante entre as mdias do PAP (ANOVA; p < 0,001). O PAP mdio nos grupos controle e PX mantiveram-se acima de 44%, enquanto os demais grupos apresentaram mdias bem inferiores (Tabela 2). A Figura 8 mostra o PAP antes e 30 dias aps o tratamento. As comparaes entre os grupos, dois a dois, mostraram que a mdia do PAP aps o tratamento foi significantemente menor no grupo FCE do que nos grupos controle (p = 0,003) ou PX (p < 0,001). No houve diferena entre as mdias do PAP quando comparados os grupos controle e PX (p = 1,00); controle e FCE + PX (p = 0,964); FCE e FCE + PX (p = 0,097); e
PX e FCE + PX (p = 0,142).
Quanto s mdias do PC das perfuraes de MT, observamos diferena estatisticamente significante entre os grupos de tratamento (ANOVA; p < 0,001; Tabela 3). O PC mdio manteve-se abaixo de 9% nos grupos controle e PX e acima de 16% nos demais. As comparaes dos grupos de estudo, dois a dois, mostraram que a mdia do PC no grupo FCE foi significantemente maior do que nos grupos controle e PX (p = 0,003 e < 0,001 respectivamente). O PC mdio no grupo FCE + PX apresentou tendncia diferena, porm no estatisticamente significante, quando comparado aos grupos FCE (p = 0,101) e
PX (p = 0,069). No houve diferena estatisticamente significante no PC mdio quando comparados os grupos controle e PX (p = 1,00) e FCE + PX e controle (p = 0,874), Figura 9.












DISCUSSO

Pouco mais da metade de nossa amostra inicial apresentou perfuraes de MT com cicatrizao inferior a 10%, quatro semanas aps o procedimento de perfurao. AMOILS et al. (23) usando modelo animal similar tiveram maior proporo de perfuraes de MT no cicatrizadas (84%), porm com critrios de incluso diferentes. Em nossa amostra as orelhas foram rigorosamente selecionadas para tratamento e em nenhum caso foi repetido o procedimento de perfurao nas MT com cicatrizao espontnea, tcnica adotada por aqueles autores. Por outro lado DVORAK et al. (12), usando modelo animal idntico ao descrito por AMOILS et al. (23) obtiveram 31% de perfuraes de MT no cicatrizadas.
Em estudo retrospectivo, GRIFFIN (19) observa que 70% das perfuraes traumticas de MT cicatrizam espontaneamente em 30 dias e que esta taxa de cicatrizao cai para 18% nos meses subsequentes. As perfuraes realizadas em MT de chinchilas neste estudo podem ser consideradas subagudas j que aps 30 dias de observao tomamos o cuidado de excluir as orelhas com PC igual ou maior que 10%. Este critrio foi adotado para cobrir qualquer margem de erro da medio e garantir que os eventos observados aps este perodo pudessem ser atribudos apenas interveno em questo. Alm disto, em estudo anteriormente publicado realizamos anlise histolgica e imunohistoqumica de 16 MT, 30 dias aps o procedimento de perfurao (24). Os resultados observados mostraram ausncia de miofibroblastos que expressassem -actina de msculo liso, clula esta indispensvel na contrao de todo e qualquer tecido em cicatrizao, sugerindo cronificao do processo com surtos de reagudizao, o que refora a natureza subaguda das perfuraes induzidas pelo modelo animal por ns utilizado (24).
O efeito final do tratamento sobre as perfuraes de MT foi diferente entre os grupos. A cicatrizao parcial e/ou total foi duas vezes mais freqente nos grupos FCE e FCE + PX do que nos demais, enquanto a ausncia de cicatrizao foi mais freqente nos grupos controle e PX. Nossos achados no podem ser diretamente comparados aos de outros autores (10-12), pois os mesmos trataram perfuraes consideradas crnicas, usaram dois grupos de estudo (com ou sem FCE) e consideraram como desfecho apenas a cicatrizao total das MT. Contudo, concordamos com AMOILS et al. (10) e LEE et al. (11) que a probabilidade de cicatrizao maior quando se utiliza o FCE.
O PAP mdio e seu desvio-padro antes do tratamento foram semelhantes entre os grupos, assegurando que as perfuraes de MT possuam aproximadamente o mesmo tamanho inicial. A diferena estatisticamente significante na mdia do PAP, 30 dias aps o tratamento, entre os grupos, mostra que as drogas utilizadas influenciaram de modo diverso a cicatrizao das perfuraes de MT.
O FCE, no esquema posolgico usado, promoveu um PC das perfuraes de MT 1,8 vezes maior do que no grupo FCE + PX, 3,5 vezes maior que no grupo controle e 8,4 vezes maior que no grupo PX. O PC em cada grupo representa um perodo de tempo de 30 dias, considerando que o PAP inicial da MT era de aproximadamente 50% e supondo que este PC se mantenha contnuo, a cicatrizao estaria completa em 1,5 ms aps o incio do tratamento no grupo FCE, em trs meses no grupo FCE + PX, em 5,5 meses sem qualquer tratamento e em 12,5 meses no grupo PX.
Os estudos experimentais que testaram o FCE em perfuraes crnicas de MT mostram resultados conflitantes. AMOILS et al. (10) e LEE et al. (11) observaram que o percentual de perfuraes de MT com cicatrizao completa foi trs a quatro vezes maior no grupo FCE do que no grupo controle, enquanto DVORAK et al. (12) no conseguem reproduzir estes resultados. Parte desta discrepncia pode ser decorrente do trauma mecnico e do sangramento induzidos na MT durante as trocas repetidas da esponja de gelatina (mais de seis vezes por orelha), o que deve ter favorecido a cicatrizao espontnea no grupo controle.
Apesar do FCE no ser liberado para uso em humanos, RAMSAY et al. (13) realizaram um ensaio clnico aberto em que pacientes com otite mdia crnica foram tratados com FCE, porm observaram cicatrizao mdia das perfuraes de MT similar entre os grupos de estudo e placebo. possvel que parte deste resultado se deva s pequenas doses empregadas e ao curto tempo de exposio droga.
A idia de associar o FCE com a PX foi baseada no fato de que todo tecido necessita de oxigenao e vascularizao suficientes para que ocorram mitose e replicao celular, e que a anxia e as endoxinas inibem estes eventos (25). Nossa hiptese era que o uso de um indutor de fluxo sanguneo, como a PX, poderia potencializar a ao mitognica do FCE na cicatrizao da MT. Contudo, no observamos benefcio com o uso da PX em perfuraes de MT em chinchilas. Pelo contrrio, observamos menores PC da MT nos grupos que receberam PX. Este PC foi cerca de duas vezes menor no grupo FCE + PX quando comparado ao grupo FCE e 4,5 vezes menor no grupo PX quando comparado ao grupo FCE + PX, com tendncia a uma diferena estatisticamente significante pelo teste "post-hoc". Isto sugere que a PX provavelmente interfere negativamente na ao do FCE. Publicaes demonstram que os efeitos celulares da PX, em especial a inibio da fosfodiesterase, no so restritos aos eritrcitos (26, 27). O aumento nas concentraes intra-celulares do adenosina monofosfato cclico ocorre em outros tipos celulares como fibroblastos e queratincitos tratados com PX, o que resulta na inibio da proliferao celular, provavelmente por modulao para menos da ao de citocinas e de fatores de transcrio nuclear (26, 27).
JULL et al. (17) em reviso sistemtica sobre os efeitos da PX em lceras cutneas crnicas concluem que o frmaco 41% mais efetivo que o placebo na cicatrizao destas leses. Apesar de nossos resultados no poderem ser comparados com o destes autores, nossa expectativa inicial com o benefcio da PX era bem maior. possvel que os bons resultados observados por eles (17) possam ser atribudos em parte aos efeitos anti-inflamatrio e anti-fibrognico do frmaco, fato este at pouco tempo desconhecido (28, 29). De acordo com estes autores a PX capaz de reduzir a produo de citocinas pr-inflamatrias e de fatores indutores da fibrinognese, limitando a proliferao celular (28, 29).
Nossos resultados no so comparveis aos de LIM et al. (18), pois estes usaram a PX em um modelo experimental de perfuraes agudas de MT em cobaias, com grande potencial de cicatrizao espontnea, o que em parte compromete a avaliao da ao isolada do frmaco. Contudo, assim como esses autores, no observamos benefcio com o uso da PX sobre o PC de perfuraes de MT.

CONCLUSO

O FCE auxiliou o processo de cicatrizao de perfuraes subagudas de MT de chinchilas, o que no se observou com a PX. A associao da PX com o FCE no potencializou seu efeito.
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