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Ano: 2007  Vol. 11   Num. 2  - Abr/Jun Print:
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Investigao da Deleo Mitocondrial mtDNA4977 em Pacientes Brasileiros com Presbiacusia
Investigation of Mitochondrial mtDNA4977 Deletion in Brazilian Patients with Presbyacusis
Author(s):
Mrcio Coimbra Pereira1, Jos Victor Maniglia2, Vnia Belintani Piatto3, Magali A. O. M. da Silva4, Luciana Venncio Secches5, rika Cristina Pavarino Berteli6, Eny Maria Goloni Bertollo6, Otvio Augusto Vasques Moreira7
Palavras-chave:
Presbiacusia. Deficincia auditiva. DNA mitocondrial. Anlise molecular. Deleo mtDNA4977.
Resumo:

Introduo: A presbiacusia a causa mais comum de deficincia auditiva, geralmente associada ao envelhecimento, em pases industrializados. A possibilidade para a identificao de mutaes genticas associadas presbiacusia tem importante significado clnico. Objetivo: avaliar a presena da deleo mitocondrial de 4977 pares de bases em pacientes brasileiros com presbiacusia documentada. Material e Mtodo: Estudo de casos em corte transversal. Cem pacientes no relacionados, de ambos os gneros, foram clinicamente examinados para se excluir formas sindrmicas de surdez. O DNA foi extrado de amostras de leuccitos de sangue perifrico e primers especficos foram designados para amplificar o gene do citocromo b e a deleo de 4977pb do DNA mitocondrial, usando a tcnica da reao em cadeia da polimerase. Resultados: Uma regio do gene do citocromo b foi amplificada sendo confirmada a presena do DNA mitocondrial em todas as amostras de leuccitos, assim como a regio no-deletada do DNA mitocondrial. A deleo mitocondrial mtDNA4977 no foi identificada em todas as amostras analisadas. Foram encontradas as presbiacusias, do tipo sensorial, neural e estrial, respectivamente, em 38, 23 e em 18 dos pacientes analisados, de acordo com os aspectos audiomtricos. Concluses: Estes resultados moleculares no so concordantes com relatos da literatura, mas no descartam a possibilidade da existncia de mutaes em outros genes nos pacientes e, reforam a importncia de se identificar as causas genticas subjacentes da presbiacusia, na populao brasileira, a fim de propiciar melhor compreenso das doenas da orelha interna.

INTRODUO

Mutaes genticas podem ocorrer em genes nucleares ou mitocondriais. As mutaes no DNA mitocondrial (mtDNA) so de herana exclusivamente materna, sendo responsveis por 0,5% a 1% das causas genticas de deficincia auditiva sensorioneural, mas podendo ocorrer mutaes espontneas. Estudos morfolgicos, bioqumicos e moleculares demonstram que a fosforilao oxidativa normalmente declina com a idade. Alm disso, delees no DNA mitocondrial tm sido encontradas em vrios tecidos humanos, de idade avanada, e em tecidos de pacientes com doenas degenerativas (1).

Estudos demonstram que a deficincia auditiva progressiva, associada idade, ocasionada por uma deleo mitocondrial de 4977 pares de bases (pb), denominada del mtDNA4977 sendo, comumente, relacionada presbiacusia, de ocorrncia espontnea e sem histria familial (2,3). A presbiacusia caracterizada por uma deteriorao progressiva, insidiosa e bilateral da sensibilidade auditiva, geralmente associada idade, apresentando um padro de curva descendente, com perda acima de 2000Hz aos exames audiomtricos de tom puro, nos estgios iniciais. Ocorre, em parte, como consequncia de alteraes degenerativas cocleares. Aproximadamente, 23% da populao entre 65 e 75 anos de idade e 40% da populao, acima dos 75 anos acometida, sendo esta, a forma mais comum de deficincia auditiva nos Estados Unidos (3).

classificada em quatro tipos distintos pela correlao entre os aspectos histopatolgicos e audiomtricos: sensorial, neural, estrial ou metablica e condutiva coclear podendo, essas classificaes, terem diferentes bases moleculares (4). Em adio a essas quatro classificaes, h mais duas outras: mista (associao de um ou mais tipos) e indeterminada (no h possibilidade de correlao entre os critrios histopatolgicos e audiomtricos) (5). O objetivo do presente estudo verificar, pela tcnica da PCR, a freqncia da mutao mitocondrial del mtDNA4977, em pacientes brasileiros com presbiacusia documentada.


CASUSTICA E MTODO

No perodo de Maro a Junho de 2006, foi realizado um estudo de corte transversal, no qual foram estudados 100 pacientes, do Ambulatrio de Otorrinolaringologia da Instituio, de ambos os gneros (61 do gnero masculino e 39 do gnero feminino), com idade entre 48 anos e 89 anos, com presbiacusia documentada. Os pacientes foram includos no estudo aps serem avaliados pelo menos por duas vezes aps o diagnstico de presbiacusia. Em todos os pacientes includos foram realizadas as avaliaes clnica, sempre pelo mesmo otorrinolaringologista, audiomtrica, em ambas as orelhas, pela mesma audiologista e a avaliao molecular do DNA mitocondrial pelo mesmo pesquisador. Foi obtido o termo de consentimento informado de todos os pacientes ou responsveis.


2.1 Avaliao clnica

Cada paciente foi submetido completa anamnese para investigar idade de incio da deficincia auditiva, presena de outros casos na famlia e excluir a possibilidade de causas ambientais: infeces materno-fetais, complicaes perinatais, meningites, uso de drogas ototxicas, trauma acstico, diabetes, etc. Os exames fsicos, otorrinolaringolgico e sistmico, foram realizados para se excluir sinais sugestivos de formas sindrmicas de deficincia auditiva (especialmente dismorfismo crniofacial, alteraes tegumentares, anomalias de origem branquial, cardaca, tireoidiana, distrbios da viso, miopatias associadas ou no a diabetes, distrbios de marcha, etc.). Alm disso, os pacientes foram submetidos avaliao oftalmolgica (incluindo fundoscopia), testes vestibulares e tomografia computadorizada de osso temporal. Estes exames foram realizados para se excluir pacientes com deficincia auditiva causada por fatores ambientais, malformaes congnitas de orelha interna ou por sndromes genticas.

Os pacientes foram audiologicamente testados por imitanciometria, com o aparelho Modelo ZODIAC 901 - MIDDLE EAR - ANALYZER MEDSEN ELETRONIC (EUA), e audiometrias de fala e de tom puro, com o audimetro de diagnstico - Modelo MAICO MA 41 (Maico Hearing Instruments INC, Minepolis, EUA), realizada no Ambulatrio de Fonoaudiologia da Instituio e includos aqueles com os seguintes parmetros audiomtricos para o diagnstico e classificao da presbiacusia (4,5): a) sensorial - queda nas freqncias agudas, geralmente com boa discriminao, podendo poupar as freqncias da rea da conversao. Audiograma em curva descendente, de progresso lenta e o ndice de reconhecimento de fala (IRF) pouco afetado; b) neural: h perda maior da discriminao vocal e menor perda dos limiares tonais. Audiograma em curva descendente e o IRF muito baixo; c) metablica (estrial): h boa discriminao vocal e o IRF baixo. Curva audiomtrica plana, com perda em todas as freqncias; d) condutiva coclear (mecnica): audiograma em curva descendente com a discriminao, geralmente, preservada; e) mista: associao das diferentes classificaes; e) indeterminada: curva audiomtrica compatvel com a da presbiacusia, mas sem correlao com as da classificao.


2.2 Anlise molecular

O DNA genmico (nuclear e mitocondrial) foi extrado de amostras de leuccitos de sangue perifrico coletadas de cada paciente selecionado, usando o GFXTM Genomic Blood DNA Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc.), de acordo com o protocolo do fabricante, sendo o procedimento realizado na Unidade de Pesquisa em Gentica e Biologia Molecular (UPGEM) da Instituio.

Para se detectar a deleo mtDNA4977, fragmentos do DNA mitocondrial, que abrangem a regio da deleo, foram amplificados pela tcnica da Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) sendo utilizados dois pares de iniciadores ou primers, que so oligonucleotdeos sintticos (6). O par 1 foi sintetizado de modo que abrangesse as seguintes posies do DNA mitocondrial: primer foward (F1), posio de 8225 a 8247 e o primer reverse (R1), posio de 13574 a 13551. O comprimento do nucleotdeo flanqueado pelos primers F1-R1 (par 1) de 5350 pb no DNA mitocondrial normal. E, o primer foward do par 2 (F2), foi sintetizado de modo que abrangesse as posies 13176 a 13198, e o primer reverse (R2), as posies de 13724 a 13705. O tamanho esperado do fragmento amplificado pela PCR usando os primers F2-R2 (pair 2) de 549 pb no DNA mitocondrial no deletado. Um fragmento de 373 pb amplificado, pelos primers F1-R1 (par 1), na presena da deleo de 4977 pb, comumente observado no DNA mitocondrial mutante. A deleo mtDNA4977 ocorre entre duas sequncias diretas repetidas (ACCTCCCTCACCA) no DNA mitocondrial, nas posies 8470-8482 e 13447-13459.

Todas as amostras tambm foram analisadas para amplificao de determinada regio do gene do citocromo b. Esta regio especfica, uma rea altamente conservada do genoma mitocondrial, atua como um controle para verificar a presena do DNA mitocondrial, nas amostras do estudo. Com primers especficos para esta regio, um produto de 161 pb esperado ser amplificado aps tcnica da PCR (7).

Todos os primers utilizados para a realizao das PCR abrangem regies, da sequncia mitocondrial codificada, do Human Mitochondrial DNA Revised Cambridge Reference Sequence (8) e todas as reaes de PCR foram processadas em ciclador de temperatura (Eppendorf, Modelo Mastercycler Personal, EUA).

Os produtos das reaes de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 2,0% em tampo TBE 1X, contendo brometo de etdio, na concentrao de 0,5mg/mL, submetidos iluminao ultravioleta, para confirmar o sucesso da reao e o gel, fotodocumentado.


Aprovao Comit de tica

O estudo foi aprovado (Protocolo n083/2005) pelo Comit de tica em Pesquisa Humana da presente Instituio e pelo Comit Nacional em Pesquisa Humana de Braslia (DF), Brasil.


Estudo estatstico

Foram avaliados 100 pacientes, em estudo piloto, para estimativa da proporo (p) de portadores da deleo mitocondrial mtDNA4977 nesta amostra inicial. A esta proporo (p), aps ter sido determinada, foi aplicada a frmula estatstica "dimensionamento de amostra com populao conhecida", obtendo-se o tamanho da amostra final (n) necessria para representar estatisticamente a populao total (Np) de pacientes atendidos no perodo determinado para a realizao da pesquisa (Np=123 pacientes). Para o clculo da amostra final (n) foi utilizada a referida frmula estatstica, com os seguintes parmetros: p=0,00 (estimado pela amostra piloto); q=0,99; zc=3,00 (99,74% de confiabilidade); e=0,03 (3% de erro de estimativa); Np=123 (tamanho da populao no perodo do estudo).

Formula: (n = zc2 p q Np/e2 (Np - 1) + zc2 p q)


Foram calculadas porcentagens e mdias com os desvios padres das mesmas, sendo os resultados expressos, respectivamente, em %, (DP%) e , (DP).


RESULTADOS

Do total de 100 pacientes brasileiros, 61 (61%, DP% =4,87) so do gnero masculino e 39 (39%, DP% =4,87) do gnero feminino. Em relao faixa etria, a idade variou de 48 a 76 anos para o gnero masculino, sendo a mdia de 70,35 anos (DP=1,02) e para o gnero feminino a idade variou de 54 a 89 anos, sendo a mdia de 74,03 anos (DP=1,06).

Os resultados, a seguir, so apresentados conforme obtidos aps realizao das tcnicas moleculares: extrao de DNA genmico (nuclear e mitocondrial) e tcnica da PCR, com posterior eletroforese em gel de agarose.


Extrao do DNA genmico:

Foi possvel a extrao do DNA, partir de leuccitos de sangue perifrico, de todas as amostras do estudo (100%).


Tcnica da PCR para amplificao do gene do citocromo b:

Realizada para se confirmar a presena ou no de DNA mitocondrial nas amostras. Foi possvel a amplificao do gene do citocromo b, em um fragmento de 161 pb, confirmando-se a presena de DNA mitocondrial em todas as amostras do estudo (100%).


Tcnica da PCR para amplificao do fragmento que abrange a regio da deleo de 4977 pb:

Realizada para se verificar a presena ou no da deleo. No foi identificado, em todas as amostras (100%), o fragmento de 373 pb que seria amplificado caso houvesse a deleo. Portanto, observou-se o fragmento de 5350 pb indicando que as amostras do estudo no apresentam a referida deleo.


Tcnica da PCR para controle de amplificao:

Realizada como controle de amplificao da PCR, que abrange a regio da deleo, a fim de se confirmar a presena ou no da deleo nas amostras pois, o produto desta PCR, um fragmento de 549 pb, se amplifica nos genomas mitocondriais normais, o que no ocorre nos deletados. Foi possvel a amplificao do fragmento de 549 pb confirmando-se, portanto, a ausncia da deleo de 4977 pb em todas as amostras do estudo (100%).

Os resultados relacionados classificao da presbiacusia, de acordo com os critrios audiomtricos, esto apresentados na Tabela 1.




DISCUSSO

Este estudo permitiu, pela tcnica da Reao em Cadeia da Polimerase (PCR), realizar a anlise molecular do DNA mitocondrial a fim de investigar a frequncia da deleo mtDNA4977 em pacientes brasileiros com presbiacusia.

Desde que o conceito de deficincia auditiva associada idade foi introduzido no final do sculo XIX, extensivos estudos tm sido realizados para o diagnstico etiolgico, patolgico, histolgico e epidemiolgico da presbiacusia e, embora seja comum em pases industrializados, rara em outros pases podendo, essa diferena, ser atribuda a diferenas ambientais, dietticas e fatores genticos (2,9,10).

Uma vez que impossvel de se analisar a deleo comum do envelhecimento de amostras extradas do osso temporal de indivduos vivos, alguns estudos tm utilizado a tcnica da PCR para verificar a presena de delees no DNA mitocondrial, no apenas em amostras arquivadas de osso temporal humano (2,10-12), mas tambm em leuccitos humanos (6,13), como realizado no presente estudo, mesmo podendo no refletir a quantidade de mitocndrias existentes no tecido sensorial auditivo (6).

Em estudos realizados foram encontradas a deleo mtDNA4977 e a mutao mtDNA A3243G em pacientes japoneses com surdez sensorioneural, revelando que possvel a identificao de delees e/ou mutaes no DNA mitocondrial pela anlise em leuccitos, encontrando, respectivamente, a frequncia de 75% (45/60) (6) e 15% (3/20) (13) nos casos analisados.

O nmero da amostra do presente estudo, 100 casos, foi muito superior aos estudos realizados tanto em cortes histolgicos de cclea humana ou de roedores como em leuccitos humanos, variando de 3 a 60 casos (2,6,7,12,13). A metodologia utilizada no presente estudo foi semelhante s descritas na literatura (6,7), permitindo a amplificao do DNA mitocondrial no-deletado e da regio especfica do gene do citocromo b, uma rea altamente conservada do genoma mitocondrial atuando como um controle para verificar a presena de DNA mitocondrial nas amostras.

Mas, mesmo com uma casustica maior e metodologia rigorosamente semelhante aos estudos de referncia (6,7) no foi encontrada a deleo mtDNA4977 em todas as amostras analisadas, diferentemente dos estudos revisados que encontraram a deleo em uma frequncia de 47% a 66% dos casos, inclundo anlises em cortes histolgicos de cclea e em leuccitos, conforme referido anteriormente (2,6,7,12,13). Exceo ao nico estudo descrito (2) no qual os autores analisaram cortes histolgicos arquivados de osso temporal de trs pacientes com presbiacusia, encontrando um paciente sem a deleo mtDNA4977.

No presente estudo, os fentipos dos pacientes com presbiacusia esto de acordo com a classificao de SCHUKNECHT et al. (1993) (4,5), seguindo-se os padres da curva audiomtrica. Mesmo a maioria tendo apresentado os tipos mais comuns sensorial, neural e metablica, no foi estabelecida relao molecular nos diferentes fentipos encontrados na amostra, apesar de os critrios de seleo dos pacientes e resultados fenotpicos do presente estudo terem sido semelhantes aos da literatura, nos quais foi determinada uma relao de hereditariedade, isto , pacientes com os tipos sensorial ou estrial apresentaram a deleo, permitindo aos autores estabelecerem uma relao molecular com as alteraes histopatolgicas existentes nos vrios tipos de presbiacusia encontrados (14,15).

As diferenas nos resultados moleculares obtidos no presente estudo poderiam ser explicadas por algumas razes que talvez justificassem o porque destes pacientes com presbiacusia no apresentarem a deleo: as diferentes classificaes da presbiacusia, a sua heterogeneidade gentica e o fato de a mesma ser um processo multifatorial influenciado por fatores hereditrios e variveis ambientais (7) alm de, a composio tnica da populao brasileira ser altamente heterognea, resultando em diferentes ndices de prevalncia entre as regies brasileiras, justificando, conforme descrito na literatura, que a presbiacusia faz parte de processos multifatoriais podendo ocorrer diferenas etiolgicas entre diferentes sociedades (7,11,16).

Provavelmente, a susceptibilidade ao acmulo de delees mitocondriais varia entre indivduos e entre diferentes populaes. Em algumas pessoas o acmulo de delees, durante o processo de envelhecimento, talvez possa ocorrer mais lentamente contribundo, juntamente com outras alteraes mutagnicas no DNA mitocondrial tais como as leses induzidas pelos radicais livres, para a perda da produo bioenergtica mitocondrial. Sendo assim, a quantidade de delees e o limiar para a expresso das doenas mitocondriais podem variar entre indivduos e populaes (17).

Muitas delees podem contribuir para a presbiacusia e a deleo mitocondrial mtDNA4977 pode ser apenas uma delas. A identificao de causas genticas subjacentes da presbiacusia fundamental para auxiliar no aconselhamento de famlias e para permitir reabilitao precoce tendo, como consequncia, a incluso e/ou reincluso nas atividades sociais e profissionais, alm de propiciar um convvio familiar digno a todos estes pacientes.

H a necessidade de um estudo multicntrico para se determinar a atual prevalncia da deleo mtDNA4977 na populao brasileira e, tambm, para investigar outras mutaes que possam estar associadas ao envelhecimento e a presbiacusia.


CONCLUSO

A ausncia da mutao del mtDNA4977, no genoma mitocondrial, no descarta a possibilidade da existncia de mutaes em outros genes nos pacientes com presbiacusia, o que sugere a necessidade de estudos posteriores.

A tcnica da Reao em Cadeia da Polimerase (PCR), com o protocolo utilizado, um mtodo de fcil execuo para rastreamento da deleo mitocondrial mtDNA4977 colaborando, portanto, para a investigao molecular da presbiacusia.


AGRADECIMENTOS

Agradecemos aos pacientes que sem os seus consentimento e cooperao, este estudo no seria possvel. Esta contribuio extremamente importante para permitir a continuidade das pesquisas cientficas a fim de proporcionar um futuro melhor aos brasileiros. Agradecemos a nossa amiga e tradutora Ceclia Meneguette Ferreira, por seu considervel auxlio.


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1. Mestre. Professor Adjunto.
2. Livre-Docente. Chefe Departamento de Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabea e Pescoo.
3. Professor Doutor. Professor Adjunto
4. Mestre. Chefe do Servio de Fonoaudiologia.
5. Mestre. Enfermeira Chefe do Ambulatrio de Otorrinolaringologia.
6. Professora Doutora. Biloga.
7. Graduando em Medicina. Graduando 6 Ano em Medicina.

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Este artigo foi submetido no SGP (Sistema de Gesto de Publicaes) da R@IO em 21 de fevereiro de 2007 . Cod. 223. Artigo aceito em 29 de maro de 2007.
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