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Ano: 2010  Vol. 14   Num. 3  - Jul/Set Print:
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Deteco do Rearranjo da Protena BCL2/JH em Carcinomas Epidermoides de Boca e Faringe
Detection of Protein BCL2/JH Rearrangement in Epidermoid Carcinomas of Mouth and Pharynx
Author(s):
Jair Montovani1, Magaly M. Sales2, Maria Ins M. C. Pardini3.
Palavras-chave:
translocao gentica, biologia molecular, neoplasias bucais, neoplasias farngeas.
Resumo:

Introduo: A protena BCL2 encontrada na membrana mitocondrial interna, regula a apoptose inibindo a morte celular programada. A translocao (14;18), detectada em 70 a 85% dos linfomas foliculares, leva a superexpresso da protena BCL2, pela justaposio do gene BCL2 ao segmento JH do gene da cadeia pesada da imunoglobulina. Porm, os achados da expresso da BCL2 em carcinoma de cabea e pescoo so contraditrios. Objetivo: Investigar a presena da translocao (14;18) do gene BCL2 em carcinomas de cabea e pescoo. Mtodo: Foram examinadas 16 amostras de DNA, sendo 13 de carcinomas de clulas escamosas (CCE) e 3 de epidermoide (CE), por meio da reao em cadeia da polimerase (PCR). Resultados: O rearranjo BCL2/JH foi encontrado em 2 (15%) dos 13 casos de CCE e em nenhum dos 3 casos de CE. A mdia de frequncia de molculas com rearranjo foi de 46,44 x 107. No foi observada associao entre a presena de rearranjo e a exposio ao tabaco e lcool (p=0,6545). Concluso: Diferente dos resultados encontrados em linfomas foliculares a presena da translocao (14;18) em carcinomas de cabea e pescoo no comum e, quando ocorre, pode ser uma mutao ocasional no associada a exposio ao tabaco e lcool.

INTRODUO

O gene humano BCL2 est localizado no cromossomo 18q21 numa orientao telmero-centrmero e consiste de trs exons (Figura 1). A protena BCL2 encontrada na membrana mitocondrial interna, regula a apoptose, inibindo as clulas da morte celular programada (1). A translocao (14;18) (q32;q21), detectada em 70-85% dos linfomas foliculares, leva a superexpresso da protena BCL2 pela justaposio do gene BCL2 aos segmentos JH do gene da cadeia pesada da imunoglobulina (IGH). A maioria dos pontos de quebras da t(14;18) ocorre na regio no codificadora 18q21.3 do BCL2. Estes pontos de quebras constituem as regies MBR (Major Breakpoint Region), encontrada em aproximadamente 60% dos linfomas com a t(14;18) e mcr (Minor Cluster Region), localizada a 20 kb de distncia da regio MBR (2,3,4,5).

Dados de estudos mais recentes so contraditrios na correlao entre a presena de alteraes dos rearranjos e expresso do gene BCL2/JH como valores preditivos de prognstico dos linfomas foliculares (RADOJKOVIE et al., 2008) (6). Entretanto, para DEGHIED et al. (2007) (7) a expresso dessa protena pode ser usada, inclusive restrospectivamente, para o diagnstico de casos duvidosos, como por exemplo, hiperplasias reativas. J em pacientes com expresses mnimas de BCL2/JH em amostras de sangue perifrico ou da medula ssea o correto seria testar novamente o rearranjo de BCL2/JH para excluir falsos positivos (8,9).

Diferente dos achados em linfomas, a superexpresso da protena BCL2 tem sido detectada em 30% dos carcinomas epidermoides de cabea e pescoo (10,11,12), no estando associada a presena da translocao t (14;18) (HARN et al., 1996). Poucos estudos epidemiolgicos tm indicado que o uso de tabaco e o consumo elevado de lcool so fatores etiolgicos importantes na induo de alteraes gnicas como a translocao cromossomial t (13,14,21). Porm, o rearranjo BCL2/JH tem sido encontrado em linfcitos de indivduos sadios fumantes (14,15,16,17,18) e em clulas da medula ssea de pacientes com doenas no linfoides (8,17).

O objetivo deste estudo foi investigar a presena do rearranjo BCL2(MBR)/JH em amostras teciduais de pacientes com carcinomas de boca e faringe e a possvel correlao do mesmo com a exposio ao tabaco e lcool.


MTODO

O DNA genmico foi extrado de 16 bipsias frescas de neoplasias de boca (n=13) e faringe (n=3) obtidas de pacientes com histologia confirmada de carcinoma epidermoide, virgens de quaisquer tratamentos, atravs da digesto do tecido tumoral pela proteinase-K (20 mg/ml) e extrao de DNA sem fenol-clorofrmio. As bipsias tumorais foram feitas no servio Otorrinolaringologia da Faculdade de Medicina da UNESP, Botucatu, SP, Brasil, aps os pacientes e ou responsveis legais tomarem cincia dos objetivos da pesquisa e assinarem termo de consentimento livre e esclarecido e aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa em seres humanos de nossa instituio.

A presena do rearranjo BCL2/JH (Figura 1), regio de quebra MBR, foi investigada atravs do nested PCR. 1,0g de DNA de cada amostra foi amplificado com 200 nmol dos primers MBR e JH (GRIBBEN et al.,1994) em 50l de tampo (Tris-HCl pH 7,5 a 5 mM, KCl a 25 mM e MgCl2 a 1,5 mM), 0,1 mM dNTPs e 1,25 U Taq DNA polimerase. Seguiram-se 25 ciclos de amplificao a 940C por 1 minuto, 550C por 1 minuto e 720C por 1 minuto. Na segunda reao (nested) 10l do produto da primeira reao foi reamplificado com os primers MBR-N e JH-N (200 nmol) em 50l de tampo (Tris-HCl pH 7,5 a 8 mM, KCl a 40 mM e MgCl2 a 1,5 mM), 0,1 mM de dNTPs e 1,25 U Taq DNA polimerase. Seguiram-se 30 ciclos de amplificao a 940C por 1 minuto, 580C por 1 minuto e, 720C por 1 minuto. Os produtos do nested PCR foram submetidos eletroforese em gel de poliacrilamida a 5% e corados em soluo com brometo de etdeo (50 mg/ml).

DNA extrado da linhagem celular RL com o rearranjo MBR, foi utilizado como controle positivo da reao de PCR. DNA humano, negativo para a t(14;18) e, um tubo de PCR sem DNA foram utilizados como controles negativos da reao.

O teste exato de Fisher foi usado para avaliar a correlao entre a presena do rearranjo BCl2(MBR)/JH e a exposio ao tabaco e lcool.



Figura 1. Estrutura do gene BCL2. O BCL2 contm trs exons e dois introns. As regies no traduzidas do gene esto ilustradas com as barras slidas de cor cinza, enquanto que as barras de cor preta representam as regies traduzidas.




Figura 2. Amplificaes do rearranjo BCL2(MBR)/JH em pacientes com carcinoma epidermoide de boca (CE). Eletroforese em gel de poliacrilamida 5%.




Figura 2A . Amplificaes mltiplas do rearranjo BCL2(MBR)/JH em paciente com carcinoma epidermoide de boca (CE). Eletroforese em gel de poliacrilamida 5%.




Figura 2B. Amplificaes mltiplas do rearranjo BCL2(MBR)/JH em paciente com carcinoma epidermoide de boca (CE). Eletroforese em gel de poliacrilamida 5%.




RESULTADOS

A incidncia do rearranjo BCL2(MBR)/JH foi de 12,5% (2/16) para os casos de carcinoma epidermoide de boca e faringe (Tabela 1).

A anlise da frequncia do rearranjo BCL2(MBR)/JH foi feita por molcula () nos dois pacientes positivos (Figuras 2, 3 e 4) e usou-se um modelo Poisson de anlise estatstica para o nmero de rearranjos por amostra (21). Como todas as triagens apresentavam o mesmo nmero de molculas (1 g de DNA contm 5 x 10-19 moles de cada cpia de sequncia nica= ~ 300.000 molculas), a estimativa foi dada pelo estimador Poisson usual: =1/M.ln(1-p), onde p a frao de triagens com pelo menos um rearranjo.

Nenhuma associao foi encontrada entre a presena do rearranjo BCL2(MBR)/JH e a exposio ao tabaco e lcool (Tabela 2) (P= 0,6545).

Os produtos de PCR dos pacientes positivos para o rearranjo BCL2/JH, podem ser observados na Figura 2. Fragmentos de tamanhos diferentes foram observados entre os dois pacientes com carcinoma de clula escamosa.

As Figuras 2, 3 e 4 mostram as amplificaes, realizadas em triagens mltiplas, do rearranjo BCL2(MBR)/JH dos dois pacientes que foram positivos.

O paciente 2, tabagista desde criana e etilista crnico (~ dois litros de lcool por dia), permaneceu positivo em 3 de mais 8 triagens realizadas (Figura 2A). Foram observados fragmentos de mesmo tamanho, sugerindo tratar-se do mesmo clone. A frequncia do rearranjo MBR foi de 19,32 x 10-7 molculas positivas.

O paciente 6, tabagista e etilista crnico, permaneceu positivo em 7 de mais 8 triagens realizadas (Figura 2B). Foram observados fragmentos de mesmo tamanhos (~200 pb). A frequncia do rearranjo MBR foi de 73,57 x 10-7 molculas positivas.









DISCUSSO

Uma expresso elevada do BCL2 tem sido observada em carcinomas de clulas escamosas (LAVIEILLE et al., 1998; DRENNING et al., 1998), porm, no existem relatos na literatura da presena do rearranjo BCL2/JH em tumores de cabea e pescoo. No presente estudo, o rearranjo BCL2(MBR)/JH foi investigado em bipsias frescas de 13 carcinomas de clulas escamosas e de 3 carcinomas epidermoides, provenientes de pacientes com tumores de cabea e pescoo, pelo nested PCR.

HARN et al. (1996) (12) relataram a ausncia do rearranjo MBR ao analisarem 32 casos de carcinoma de nasofaringe atravs da tcnica de PCR. Entretanto, no estudo de HARN et al. (1996) (12) foram utilizadas amostras de tecido fixado. Assim, esta discordncia na incidncia do rearranjo BCL2/JH pode ser devido a diferenas tcnicas ou amostrais.

SALO et al. (1997) (20) estudaram o estado do gene BCL2 em 9 linhagens celulares humanas de carcinoma de clulas escamosas. O cDNA do BCL2 foi amplificado em 5 das linhagens celulares, mostrando que o mRNA estava expresso nestas clulas. Os 5 cDNAs foram sequenciados, porm, mutaes de ponto no gene BCL2 no foram detectadas, indicando que a translocao provavelmente uma mudana tpica nestas clulas neoplsicas. Para VERGIER et al. (2004) (18) esses resultados sugerem que um dos mecanismos da superexpresso do BCL2 em carcinomas de clula espinocelulares, pode ser devido a translocao cromossmica t(14;18).

BELL et al. (1995) (13) e SHULER et al. (2003) (17) relataram uma associao significativa entre o hbito de fumar e a frequncia de clulas com a t(14;18) no sangue perifrico de voluntrios sadios. Outros autores encontraram essas mesmas translocaes em indivduos com cncer associado so tabaco (8,9,15,16). No presente estudo, no foi observada uma associao entre a positividade do rearranjo MBR/BCL2 e a exposio ao tabaco e lcool nos pacientes com tumores de cabea e pescoo. Como a taxa da mutao BCL2 foi idntica tanto para fumantes e no fumantes (8,9,15), a relao antgenos do tabaco estimulando o aparecimento de clones raros de rearranjos BCL2/JH pr-existentes no foi observado nos nossos pacientes. Entretanto, a ausncia dessa associao ficou prejudicada pelo baixo nmero de indivduos estudados.

Mesmo assim, no presente estudo, um dos pacientes fumantes positivos apresentou uma frequncia elevada (73,57 x 10-7) do rearranjo BCL2 (MBR)JH e esse aumento pode ser devido expanso dominante de um nico clone e o sequenciamento do produto de PCR desse indivduo pode confirmar essa observao. Esse dado poderia ter valor preditivo de diagnstico como o mostrado por BELL et al. (1995), quando um dos indivduos fumantes (trs maos de cigarros por dia), que apresentou uma frequncia elevada do rearranjo BCL2/JH no sangue perifrico, desenvolveu melanoma (21). Este indivduo havia sido positivo 4 vezes em 4 triagens realizadas e permaneceu positivo em mais 2 de 4 triagens retestadas 8 meses mais tarde. Assim, a mensurao da taxa de translocaes t(14;18) poderia identificar indivduos com um risco maior de desenvolvimento de linfoma ou outros cnceres ou ento que responderam mal a terapia (6,7,21).

Enfim, pode-se dizer que o rearranjo BCL2(MBR)JH no est restrito a doenas linfoproliferativas e pode ser detectado em clulas neoplsicas de carcinomas primrios de boca e faringe. A translocao t(14;18), portanto, pode ser uma mutao secundria encontrada em carcinoma espinocelulares de boca e faringe mas em nosso caso, devido ao pequeno nmero de pacientes testados, no se pde avaliar o valor prognstico da presena do rearranjo BCL2/JH nestes tumores.


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1 Livre-Docente em Otorrinolaringologia. Professor Livre-Docente, Adjunto.
2 Doutorado e Ps-Doutorado em Gentica pela UNESP.
3 Doutorado. Professora Doutora do Departamento de Clnica Mdica, Diviso Hemocentro.

Instituio: Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabea e Pescoo. Botucatu / SP - Brasil. Endereo para correspondncia: Jair Cortez Montovani - Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabea e Pescoo Distrito de Rubio Jnior s/n - Botucatu / SP - Brasil - CEP: 18603-970 - Telefone/Fax: (+55 14) 3811-6256 / 3811-6081 - E-mail: montovan@fmb.unesp.br

Artigo recebido em 16 de Dezembro de 2009. Artigo aprovado em 15 de Maio de 2010.
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